Оцінка якості бібліотек

Після приготування бібліотеки важливо визначити її якість і кількість. Це дозволить вчасно виявити невідповідність, а також визначити кількість зразка для подальшого аналізу.

Визначення кількості

Визначення кількості НК для молекулярної біології проводять за допомогою мікроспектрофотометра або флуориметра. Для визначення кількості НК після виділення можна використовувати спектрофотометричне визначення, однак для визначення кількості ДНК після приготування бібліотеки, краще підходить флуориметрія.

Спектрофотометричний метод

Суть методу полягає у вимірюванні поглинання зразку. Різні компоненти дають свій внесок у спектр – нуклеїнові кислоти мають пік поглинання на 260 нм, білки (ароматичні амінокислоти) – 280 нм, деякі речовини, що використовують при виділенні НК, – 230 нм (гуанідин, фенол).

Вплив домішок на значення оптичної густини при вимірюванні кількості ДНК

Для визначення чистоти виділених НК вираховують співвідношення абсорбції зразка при 260 нм та 280 нм.

Загальноприйняті значення співвідношення 260/280 для ДНК та РНК:

ДНК:

• < 1,7 – занизьке
• ~ 1,8 – ідеальне
• >2 – зависоке

РНК:

• < 1,9 – занизьке
• ~ 2 – ідеальне
• >2,2 – зависоке

 

Для визначення кількості використовують одне із формулювань закону Бугера-Ламберта-Бера:

А = E * b * c,

де А – абсорбція, Е – коефіцієнт екстинкції, b – довжина оптичного шляху, с – концентрація

Коефіцієнти екстинкції є характерними для кожної речовини і для ДНК та РНК вони відомі:

• – dsDNA: 50ng-cm/µl
• – ssDNA: 33ng-cm/µl
• – RNA: 40ng-cm/µl

Відповідно, щоб розрахувати концентрації ДНК чи РНК у зразку, знадобиться абсорбція (вимірює прилад) та довжина оптичного шляху (визначається приладом).

Оскільки після виділення НК отриманий зразок рідко перевищує 100 мкл, використання кюветних спектрофотометрів не є доцільним. Натомість використовують мікрооб`ємні спектрофотометри, у який для вимірювання достатньо 1-2 мкл зразка.

Зразок при вимірюванні на мікрооб`ємному спектрофотометрі

Однак важливо пам`ятати про важливі нюанси при вимірюванні концентрації НК цим методом:

1. 1. Забруднюючі речовини (фенол, гуанідин, білки, солі), що мають близькі піки поглинання (230-280 нм) будуть робити внесок у поглинання на довжині хвилі 260 нм та спотворювати отримані концентрації.
2. 2. Олігонуклеотиди, одноланцюгові та дволацюгові ДНК, РНК та праймери неможливо між собою розрізнити за допомогою цього методу. Програмне забезпечення приладу рахуватиме концентрацію відповідно до вказаної користувачем речовини (РНК, одно- чи дволанцюгові ДНК), однак отримана концентрація буде неточною, адже внесок інших НК програмне забезпечення не враховує.
3. 3. Динамічний діапазон вимірювання обмежений. Більшість приладів працює з дволанцюговою ДНК у концентрації від 2 нг/мкл до кількох тисяч нг/мкл, при цьому точність вимірювання у нижній межі діапазону дуже мала.

Таким чином, мікрооб`ємна спектрофотометрія є гарним методом для оцінки кількості та чистоти виділених нуклеїнових кислот.

Флуориметричний метод

Визначення кількості НК за допомогою флуориметра відбувається за рахунок взаємодії НК із барвником, флуоресценція якого вимірюється приладом.

Такий метод дозволяє уникнути недоліків спектрофотометричного методу:

1. 1. Забруднюючі речовини (гуанідин, фенол, білки, солі) не взаємодіють із барвником та не впливають на оптичні характеристики на вимірюваній довжині хвилі.
2. 2. Барвники з різних наборів взаємодіють із відповідними видами НК, дозволяючи виміряти РНК, одно- або дволанцюгові ДНК.
3. 3. Метод дозволяє працювати із малими концентраціями НК, які мають місце при приготуванні бібліотек NGS. Переважна більшість тест-систем працюють із такими діапазонами:

Визначення якості

Підготовка бібліотеки зазвичай призводить до накопичення продукту певної довжини. Для визначення якісного складу використовують системи для електрофоретичного розділення НК або капілярний електрофорез.

Прилади: