Технологія ddPCR

Визначення

ddPCR (Digital Drop PCR або ж цифрова крапельна ПЛР) – це різновид полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР). Реакція відбувається у суміші, розділеній на нанокраплини. Це дозволяє провести накопичення продукту з кожної молекули ДНК окремо.

Як це працює?

Крок 1. Підготовка зразків та реакційної суміші

Виділення та очищення нуклеїнової кислоти відбувається так само, як і при підготовці зразків для real-time ПЛР.

Підготовка реакційної суміші також відбувається подібно для інших різновидів ПЛР: праймери, зонди чи інтеркалюючий барвник, буфер та ферменти ретельно змішуються та дозуються відповідно до кількості зразків та контролів.

Крок 2. Генерація краплин

Картридж DG8

Зразки та реакційна суміш вносяться у картриджі для генерації краплин. Спеціальний прилад – генератор краплин змішує зразок із олією, утворюючи стійку емульсію. За рахунок великої кількості краплин та рівномірному розподілу зразка та реакційної суміші по об’єму, у кожну краплину потрапляє тільки одна молекула ДНК. Так, наприклад, 20 мкл суміші, розбиваючись на 20 000 краплин, утворюють нанолітрові краплини.

Droplet generation

Процес розділення реакційної суміші на нанокраплини всередині картриджу

Крок 3. Ампліфікація 

Для проведення ампліфікації використовують будь-який ампліфікатор, що дозволяє забезпечити відповідну точність та рівномірність розподілу. Ми рекомендуємо звернути увагу на один із ампліфікаторів чи термоциклерів Bio-Rad Laboratories.

В результаті ампліфікації кожна краплина, в яку потрапила цільова молекула ДНК, має всередині мільйони копій цільового фрагменту.

Вигляд нанокраплин після ампліфікації

Крок 4. Зчитування результатів

Для зчитування результатів використовується рідер QX200 від Bio-Rad Laboratories. Весь зразок, що пройшов ампліфікацію, витягується у капіляр, товщиною в одну нанокраплину і кожна краплина зчитується окремо. В залежності від моделі приладу можливі різні режими зчитування. Найпопулярніші:

  • комбінація флуорофорів FAM та HEX
  • інтеркалюючий барвник (наприклад, EvaGreen)

Приклад зчитування результатів:
Синя краплина – позитивна по FAM
Зелена краплина – позитивна по НЕХ
Синьо–зелена краплина – позитивна по FAM та НЕХ
Біла краплина – негативна по всім каналам детекції

Використання технології

Щоб прочитати про застосування технології ddPCR, перейдіть за посиланням.

Системи для проведення ddPCR від Bio-Rad Laboratories:

Відображаються усі з 3 результатів