Камери для горизонтального електрофорезу

Електрофорез нуклеїнових кислот

Електрофрез нуклеїнових кислот – є лабораторним методом розділення нуклеїнових кислот у гелі за їх молекулярної масою та відповідно до конформації. Зазвичай камери для горизонтально електрофорезу призначені саме для роботи з нуклеїновими кислотами.

Цей метод використовують для:

• ● розділення;
• ● ідентифікації;
• ● очищення нуклеїнових кислот.

Механізм роботи методу

Щоб поставити електрофорез нуклеїнових кислот, окрім зразків необхідно мати:

• ● Камеру для електрофорезу;
• ● Джерело живлення;
• ● Гель;
• ● Витратні матеріали (буфери, барвники, маркери).

ДНК – завдяки фосфатним групам є слабкою кислотою, тому ці молекули рухаються до позитивно зарядженого кінця – анода.

Ефективне розділення фрагментів ДНК відбувається при напрузі, що не перевищує 5 В/см гелю. Зі збільшенням напруги ефективність розділення ДНК погіршується.

Рис. 1. Принцип виконання горизонтального електрофорезу нуклеїнових кислот.

Гелева матриця для електрофорезу

При виконанні електрофорезу нуклеїнових кислот гель виготовляють з агарози. Концентрація агарози в гелі впливає на розмір пор, через які проходитимуть нуклеїнові кислоти. В таблиці 1 представлено межі молекулярних мас ДНК, що можуть бути ефективно розділені при певній концентрації гелю.

Концентрація агарози в гелі, %	Межі ефективного розділення молекул ДНК, кб
0,3	5 - 60
0,6	1 - 20
0,7	0,8 - 10
0,9	0,5 - 7
1,2	0,4 - 6
1,5	0,2 - 4
2,0	0,1 - 3

Таблиця 1. Межі молекулярних мас ДНК, що можуть бути ефективно розділені при певній концентрації гелю

Окрім концентрації гелю важливе значення мають розмір та конформація молекул ДНК. Менші фрагменти рухаються на більші відстані, більші молекули застрягають в порах на ранніх етапах, ближче до лунок для нанесення зразка. Разом з тим, одноланцюгові молекули ДНК легше проходять крізь пори, ніж дволанцюгові.

Візуалізація

Для візуалізації молекул ДНК найчастіше використовують бромистий етидій. Ця сполука інтеркалює в молекули ДНК між парами нуклеотидів, за рахунок чого в близько 20 разів збільшується інтенсивність флуоресценції барвника. Це дозволяє візуалізувати смужку, де є лише 10 нг ДНК.

Окрім бромистого етидію використовують також SYBR Green (λmax = 497 нм).

Визначення молекулярної маси

Молекулярну масу розділених нуклеїнових кислот визначають за маркерами, що наносяться у лунку поряд зі зразками. Маркери містять фрагменти ДНК з попередньо визначеною молекулярною масою, що дозволяє порівнювати їх розташування в гелі з результатами зразка.

Рис. 2. Приклад вигляду електрофореграми з використанням гелю ReadyAgarose 3%.

Камери для горизонтального електрофорезу від Bio-Rad Laboratories: